【超離應用大放送】超速離心助力基孔肯雅病毒疫苗研究
CHIKV的傳播途徑
近日，佛山市(shi)感染基孔肯雅熱（CHIKV）的病(bing)例(li)已(yi)經(jing)(jing)超(chao)過(guo)4000例(li)，引起公眾的極大(da)關(guan)注。CHIKV主要依(yi)靠埃及伊(yi)蚊和(he)白紋伊(yi)蚊叮咬傳播，已(yi)經(jing)(jing)傳染超(chao)過(guo)110個(ge)國家。世界(jie)衛生(sheng)組織估計，自2005年基(ji)孔肯雅病(bing)毒(du)重(zhong)新出現以(yi)來，它已(yi)在全球造成超(chao)過(guo)200萬例(li)嚴重(zhong)急(ji)性和(he)慢性關(guan)節(jie)炎病(bing)例(li)。
CHIKV的上市疫苗(miao)
目(mu)(mu)前(qian)有兩種CHIKV疫(yi)苗(miao)已用于幾(ji)個國家的(de)(de)高(gao)危(wei)人群，但是尚未廣泛使(shi)用，目(mu)(mu)前(qian)受到較高(gao)不良反應率和存儲條件(jian)的(de)(de)限制。在暫(zan)無(wu)特效藥的(de)(de)情(qing)況下，開發(fa)成熟可靠的(de)(de)疫(yi)苗(miao)對于疫(yi)情(qing)的(de)(de)防控仍然(ran)至關重要。
參考文(wen)獻(xian)：
Chikungunya virus and other emerging arthritogenic alphaviruses
作為(wei)病毒純化(hua)經典方法(fa)學的超速離(li)心法(fa)，廣泛應用(yong)于各種(zhong)蟲媒病毒的純化(hua)（點(dian)擊了(le)解更多(duo)蟲(chong)媒(mei)病毒的超(chao)離純化方法：超(chao)速離心在(zai)蟲(chong)媒(mei)病毒中的應用）。在CHIKV疫(yi)苗的研(yan)究(jiu)工作(zuo)中，超速離心仍然是主要的純(chun)化方法(fa)之一。
純(chun)化流程(cheng)示意圖
昆蟲細胞系中CHIKV-VLP的純化(hua)
1
通過向培(pei)養(yang)基(ji)(ji)組分中加(jia)入7%（w/v）聚乙(yi)二(er)醇(chun)（PEG）-6000和0.5M NaCl，從培(pei)養(yang)基(ji)(ji)中沉淀VLP和其(qi)他(ta)蛋白(bai)質組分，并在4°C的滾筒臺上(shang)孵育2小時。
2
在4°C下(xia)以(yi)4000×g離心(xin)沉淀(dian)15分鐘(zhong)，并將沉淀(dian)溶解在4°C的1ml GTNE緩沖液中。
3
在(zai)4°C的(de)GTNE梯度中制備不連(lian)續(xu)的(de)70%（w/v），40%（w/v）蔗糖梯度液。
4
小心地將1 ml VLP溶液加載到40%蔗糖部分的(de)頂部，不要(yao)破壞(huai)梯度。
5
在4°C的(de)超速離(li)心(xin)機中以(yi)70,000×g離(li)心(xin)2小時。
6
小心地分(fen)離(li)40-70%蔗糖界面處(chu)的VLP條帶(dai)并將其(qi)重(zhong)懸于5 ml GTNE緩沖液(ye)中(zhong)。
7
在4°C的超速(su)離(li)心機中(zhong)以(yi)85,000×g離(li)心30分鐘沉淀VLP，重懸于(yu)50μl GTNE中(zhong)，然后儲(chu)存在-80°C以(yi)供后續分析和(he)使用(yong)。
參考文獻：
Production of Chikungunya Virus-Like Particles and Subunit Vaccines in Insect Cells
衣殼完全缺乏(fa)的CHIKV減毒活(huo)疫(yi)苗純(chun)化
突(tu)變型（A）和野生(sheng)型（B）CHIKV病(bing)毒粒子的(de)密度梯度餾分(fen)組分(fen)qRT-PCR和特(te)異性抗體蛋白(bai)質印跡測定結果
在(zai)30 hpi或96 hpi下，4°C，400×g離(li)心(xin)10分(fen)鐘和5,000×g離(li)心(xin)20 min收集上清液(ye)。
0.22μm過(guo)濾器(qi)過(guo)濾，4°C下，以8%的終濃度聚(ju)乙(yi)二醇8000過(guo)夜沉淀上(shang)清液。
在4°C下以14,000×g離心(xin)1小時，使用(yong)移(yi)液器將(jiang)沉淀輕輕重懸。
將懸浮液覆蓋在(zai)20至60%線性蔗糖梯度上，并在(zai)Optima MAX-XP超速離(li)心機中使(shi)用MLS-50轉(zhuan)子在(zai)4°C下以34,000rpm超速離(li)心3小時。
從梯度中回收病毒組分。從上(shang)到下(xia)收集10 個500 μl餾分。
參考文獻：
Infectious Chikungunya Virus (CHIKV) with a Complete Capsid Deletion: a New Approach for a CHIKV Vaccine
硫酸纖維素色譜（Column）將病毒(du)濃(nong)度(du)提高(gao)100倍，然后在不連續(xu)的蔗糖(tang)梯度(du)中進(jin)行超速離心（gradient）去除雜(za)質，再(zai)通過考馬斯(si)染(ran)色檢(jian)測病毒(du)
兩步法高度純化EILV/CHIKV嵌合病毒
通過(guo)0.22 μm過(guo)濾(lv)器過(guo)濾(lv)培(pei)養(yang)基，室(shi)溫下通過(guo)硫酸纖維素（AMSBIO）色譜柱。上樣整(zheng)個體積的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)基后，用PBS洗滌色譜柱，并(bing)在(zai)最(zui)小體積（1-1.5 ml）的(de)(de)(de)7xPBS中(zhong)洗脫病毒。立即將(jiang)其加載到新鮮(xian)制備的(de)(de)(de)蔗糖梯度（1.5 ml 50%、2 ml 40%和7 ml PBS制備的(de)(de)(de)30%）的(de)(de)(de)頂部，并(bing)以36,000 rpm、4°C離心3.5小時(shi)。收集一條清晰可見的(de)(de)(de)條帶(dai)，用PBS稀釋，并(bing)將(jiang)等分(fen)試樣儲(chu)存(cun)在(zai)-80°C。
已經(jing)上市的IXCHIQ疫苗(miao)生(sheng)產也采用類似的層(ceng)析+密度(du)梯(ti)度(du)超速離心的兩步法(fa)進行純化。
參考(kao)文(wen)獻：
Optimized production and immunogenicity of an insect virus-based chikungunya virus candidate vaccine in cell culture and animal models
Chikungunya Virus Vaccines: A Review of IXCHIQ and PXVX0317 from Pre-Clinical Evaluation to Licensure
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